• 组织固定
  • 福尔马林固定,小标本固定时间为4~6小时,大标本固定时间为18~24小时。如果固定时间太短,或酒精固定的,可能导致不均匀的免疫反应。如果固定时间太长,某些抗原可能会较难检测到,除非经过优化后的抗原修复;固定时间太长可能会导致抗原活性丢失以及非特异的免疫反应。
    脱钙
    钙化组织或骨髓活检组织通过强酸进行脱钙处理可能会导致许多抗原的丢失,但弱酸和EDTA则没有影响,前提是组织必须经过合理的福尔马林固定。

  • 切片处理
  • 切片粘附和烤片
    为了尽量避免脱片——特别是在随后的热修复(HIER)过程中——3-4um厚的切片要能粘附在玻片上,防脱玻片一般可以采用多聚左旋赖氨酸(Poly-L-lysine)和APES处理。局部掉片的切片可能会由于试剂的截留而导致假阳性染色。经过37℃烤箱过夜,然后60℃再烤一小时,通常可以保证粘附效果,且不会影响抗原活性。如若将温度升至80℃或者直接放置在热板上进行烘烤,某些抗原可能会丢失。
    切片储存
    组织切片在室温下放置几周后会呈现出某些抗原渐进的和不可逆转的丢失,特别是核抗原如ER。反之,将切片放置在-80℃,可以保留抗原活性。此外,石蜡包埋切片在室温下长期放置也有可能出现小幅的抗原丢失,实际工作中可以用蜡封进行长期保存或放置于4℃冰箱短时间保存。

  • 抗原修复
  • 在福尔马林固定的组织中多数抗原会被屏蔽(但是没有被破坏),且通过对切片进行合理的预处理后可以被抗体识别。抗原热修复(HIER)已经成为目前最主要的抗原修复方法,可以应用于约80%的抗体。热修复的效果很大程度上取决于温度、时间和pH值以及缓冲液的化学成分。温度和时间呈负相关关系:高压锅120℃ 5分钟大致相当于100℃微波炉修复20分钟,或在孵育盒内60℃孵育24h。高温可能引起形态学的变化,尤其是在那些固定过短或长时间热处理的病例。
    许多抗原修复同样也受pH值的影响。常见的受pH值影响的四种不同情况如下:

    1. 修复效果较好,不受pH值范围的影响,如:CD20(L26);
    2. 在低pH值和高pH值时修复效果好,但是在pH值为3-6时有较明显的降低,如: Ki67(MIB 1),ER(1D5);
    3. 修复效果随pH值增加而提升(大多数的抗原);
    4. 只在低pH值下抗原修复效果良好(如:朊蛋白(3F4),上皮相关抗原(MOC 31))

    除了D种情况外,pH值为8-9的修复液适合于几乎所有的抗原,然而,目前在多数实
    验室都执行pH6.0的热修复。我们的经验是,随pH值从6上升到9,平均染色强度可以提高。最高pH的缓冲液为Tris/EDTA(或EGTA),部分实验室倡导加入尿素。缓冲液的pH值在9.0-9.1时是稳定的,通常不需要再进行调整。在室温条件下大约可以保持4周。
    特殊的缓冲液比如Dako靶向修复液,pH6,在少数几种情况下会比以上提到的几种修复液更有优势(如 上皮抗原(Ber-EP4);CD31(JC/70A);glycoprotein 200(66.4.C2);MOC31)
    其它主要的修复方法是蛋白消化法,跟热修复(HIER)相比,它有一些缺点:蛋白消化要求跟固定时间(通常不知道)密切相关。如果组织固定时间短,则蛋白预处理时间要缩短,否则目标蛋白也会一起被消化。如果固定时间过长,除非增强蛋白消化强度,否则修复可能不足。某些较易得到修复的抗原相应的抗体使用蛋白消化会比HIER的效果要好,如CK8/7(Cam 5.2)、PSA(28/A4)、collagen IV(CIV 22)。 链酶蛋白酶是最常使用的酶。其它酶,如胰酶,大体上未呈现出明显的优势,胃酶则似乎对胞外抗原特别有效(collagen IV,laminin)。
    显然某些抗原可以通过HIER和蛋白消化获得修复,但是可能会存在细微的差别,因而,有的抗原的修复,如神经S-100β蛋白,使用任何一种修复方法,都可以取得相同的效果,而在某些上皮细胞和横纹肌细胞只能通过热修复取得好的效果。某些上皮细胞中CK20(Ks20.8)通过蛋白酶消化后而不是热修复,会引起假阳性染色。
    在某些情况下,不论热修复或酶消化都可以获得好的抗原修复效果,但后者可能需要更高的浓度才能获得一个较佳的结果。
    一些实验室仍然在继续使用蛋白消化的预处理方式,认为仍然是一个好的方法。
    抗原修复的必要性并不总是显而易见的。比如CD117,使用Dako的多克隆抗体,我们推荐采用碱性pH值的热修复,而其它人则认为在热修复后染色强度会减弱。

  • 内源性生物素
  • 使用抗生物素蛋白-生物素蛋白的检测系统时,在热修复之后,常常由于内源性生物素的反应引起假阳性染色。一般来看,热修复越有效,暴露的生物素就越多。生物素存在于线粒体代谢活跃的细胞中,特别是肝、肾、结肠、甲状腺和乳腺以及相应的癌细胞更容易发生这种假阳性染色。
    基于亲和素和生物素的原理,内源性生物素阻断是可以实现的。比较好的选择是使用非生物素标记的检测系统。

  • 一抗
  • 选择和测试抗体
    就诊断来说,认证的抗体组合是应该进行筛选的,实验室中任何一个新的抗体都应该根据实验室既有的标准和供应商说明书进行测试,并依据临床效用来进行评估。
    最佳的抗体浓度(即最大化的特异性染色和最小化的非特异染色)与孵育时间和温度呈负相关关系。相比于最常使用的孵育时间30min,孵育2h或16h可以获得一个2倍或4的平均染色强度。延长孵育时间不仅能节省一抗,而且可以获得较低的背景染色。
    然而,这对诊断病理学并不那么有效。37℃下孵育可能会增强一抗反应性,但有时可能会引起更多的背景染色,并提高了干片的风险。
    使用合适的洗涤剂
    将洗涤剂加到一抗稀释液中,可以增加抗体的穿透能力,但是有些情况下也会萃取抗原。Tween 20保持某些抗原表位的能力似乎要比Triton X100更好。

  • 检测系统
  • 为了使信号放大,常使用间接标记技术,最常用的是过氧化物酶。优化后的亲和素-生物素系统和聚合物偶联系统一样敏感。两者的主要不同是:(1)前者是三步法,后者为二步法;(2)前者由于内源性生物素的干扰可能引起假阳性染色,但聚合物系统却可以规避这一问题。实验室从更早之前的链霉亲和素-生物素方法到最敏感的亲和素-生物素系统或Envision等聚合物系统的改变使染色强度提高了3倍。

  • 色原
  • 增强染色信号
    最常用的色原是3,3,二氨基联苯胺(DAB)和3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)。DAB的优点是使用咪唑和金属盐,如硫酸铜,使敏感度增强;而且DAB允许疏水性嵌入。一种新型红色色原,NovoRed,几乎和DAB一样敏感,也允许疏水性嵌入。改良后的AEC和DAB可以获得平均4倍的染色强度。

  • 对照
  • 临床免疫组化需要什么样的对照呢?
    患者的样本需要配合两种类型的对照:阳性对照片和阴性对照片。大体上,每个抗体都要准备一个阳性对照片,阴性对照片应该包含预处理组织的每个类型。使用合适的抗体组合可以自动获得阴性对照片。

    阳性对照片可以使用哪种组织呢?
    阳性对照组织是预先已知某种抗原表达水平的组织。高抗原表达水平的良性组织常用作阳性对照,然而,对临床实验室而言,这类组织量都不足。鉴于许多肿瘤的抗原含量会随肿瘤分化程度而变化,如果我们使用富含抗原的对照,常会出现假阴性结果。生物染色委员会(罗切斯特大学医学中心)和几位作者建议设置低靶向抗原水平对照组织以确保染色系统有足够的敏感度来标记(染色)低抗原水平,并降低假阴性结果的风险。
    免疫组化多组织对照块对于临床实验室而言是理想的。从1986年Hector Battifora 医生介绍了这种组织块后,目前已经有多种技术用来制备这种组织块。
    总体上,组织可以前瞻性或者回顾性地收集。通过回顾性收集组织会容易些。然而,组织的前瞻性收集也能取得好的结果。要记录或收集那些足够大的、将用作阳性对照并且含有抗原表达能力弱的组织,因为这些组织比较难获得。对照组的组织固定方式要与受测组织相同,用于B5-固定的淋巴结和骨髓活检组织时,我们常规使用B5-固定组织来制备多组织块。

    多组织块中需要置入多少组织样本?
    这取决于组织块的目的。我们的实验室使用几种不同的多组织块。其中一种是“上皮/间皮“对照,包含大概10个来源于各种癌和间皮瘤的组织片段。
    这类多组织块用于各种上皮和间皮标记物(AE1/AE3, Cam5.2, CK8, CK19, CK20, CK7, CK5/6, BerEP4, MOC31, calretinin, GCDFP-15等)。还有一种“黑色素瘤”多组织块,包含4种黑色素瘤和一个痣,用作vimentin, S-100 , HMB-45 和 melan-A的对照。目前尚没有阳性对照的标准设计。如果对于如何制备阳性对照片要保持某一基本的准则—最终的设计将由执业病理学家来决定,他们准备这些阳性对照以适应他们的实际需要。比如,如果你要进行繁忙的乳腺病理时间,你可能需要制备用于ER和PR分析的多组织块,以包含呈现每种抗原强、中和弱表达的肿瘤组织。

    阳性对照片是否有必要都制备成多组织块?
    不,事实并非如此。你可以使用已知抗原表达的某一种组织/器官。最常使用的阳性对照是正常阑尾。例如,对于CD23而言,这是一个完美的对照,因为生发中心的滤泡树突状细胞呈现出CD23强阳性表达,且在滤泡的套区有无数呈弱表达的细胞。它也可以作为内源性生物素的对照,因为在同一组织中有大量的上皮细胞。除了具有众多抗原(actin、SMA、CD45、 CD20、 CD3、 CD4、 CD8、 CD5、 CD21、 CD23、 CD35、 AE1/AE3、 Cam5.2、 CK8、 CK20、 CD34等)的丰富表达外,一个正常的阑尾组织也是好的阳性对照,因为它能非常低地表达许多抗原。它对bcl-2(淋巴组织阳性,良性生发中心阴性,肠腺梯度表达)、CD10(生发中心表达,在表层基底膜弱表达)、CD23(滤泡树突状细胞和套区)、CD45(淋巴细胞,单核细胞,巨噬细胞和固有层中浆细胞微弱表达)以及其它抗体都是理想的对照。而且,组织的横切片很小,可以给患者的样本留下充足的空间。如果确定恶性细胞只弱表达CD30和CD15,可以使用经典霍奇金淋巴瘤病例作为CD30/CD15的阳性对照。肾组织的一张切片可以作为CK(pan)的优秀对照片,CK(pan)在肾小管和鲍曼氏囊不同部位表达不一。

    如何找到某种特定抗原的弱表达组织?
    要确定肿瘤组织是真的“弱阳性“是很困难的。但借用已经建立的实验室的阳性对照片中的未染色切片是个不错的选择,可以保证你的选择是正确的。

    阴性对照可以用什么组织?
    阴性对照从患者的样本/活检组织中获得。也有来源于用于特殊染色的蜡块也会用作阴性对照。

    每一个受测切片旁是否有必要放上一张阳性对照?
    是的,这样的做法是在实验室中实际操作的。有时,我们发现病人的样本呈阴性,但阳性对照片上也是阴性。有时并不清楚是怎么回事,因为用同样的抗体对所有其它样本测试都是阳性的。大多数时候,某个抗体在所有的切片上都呈现一致的结果,然而,不同的切片可能会发生一些变化。如果所有的切片都没有阳性对照,那么在性能测试时就注意不到这些变化。